| 产品索引 | 5872 |
| 中文名称： | PCR产物及凝胶回收试剂盒 |
| 英文名称： | MagExtractor®-PCR & Gel Clean up- |
| 产品编号： | NPK - 600 |
| 产品类别： | 分子生物学 |
| 生产厂家： | TOYOBO |
| 产品价格： | 300元 |
| 产品规格： | 50次 |
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用说明书
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
—目录—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 纯化流程...................................................................................... 2
[3] 试剂盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收琼脂糖凝胶........................................................................... 5
[7] 疑难解答...................................................................................... 8
注意：
本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断，临床等场合。在使用本试剂盒的时候，请严格遵守实验室的基本注意事项，注意安全。由于本试剂盒内含有对人体有害的试剂，所以请务必严格遵守各试剂的相关使用说明书，按要求使用保护罩等防护措施。
[1] 前言
MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic（盐）试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅胶上的特性1），用于手动对DNA片段进行纯化。本试剂盒采用磁硅胶粒子，若使用磁性台架，则能最大限度地减少复杂的离心操作，能够快速地的纯化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
| ·从DNA溶液（约100μl），以及TAE·TBE琼脂糖凝胶（约0.3g）中， 能够以平均回收率60～70％比例回收DNA片段（约100bp～50kbp）。 ·能够在5分钟之内从DNA溶液中，或者在15分钟之内从琼脂糖凝胶 中回收DNA片段。 ·由于在室温下琼脂糖凝胶可以被融解，因此无需进行加热反应。
* 要彻底去除混杂在回收液中的乙醇时则需要进行加热处理（55℃）。 |
试剂盒的用途
| ·脱盐，去除dNTPs。 ·去除引物。 ·去除酶（碱性磷酸酶等）。 ·从电泳后的琼脂糖凝胶块中回收DNA。 |
回收的DNA的用途
| ·RI.Non-RI测序反应 ·限制酶反应 ·标记反应 ·杂交反应 ·连接反应 ·转化反应 ·扩增反应 |
[2] 纯化流程
下图显示为使用MagExtractor-PCR &
Gel Clean up-时的纯化流程。
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纯化DNA片段
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Elute
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75％乙醇
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洗净液
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溶出液
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磁石 磁性或离心分离
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磁珠
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Wash
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Bind
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Melt
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凝胶块
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吸附液
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电泳后的凝胶
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[3] 试剂盒中所包含的物品
本试剂盒中包含以下试剂。（200次份）
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| 试剂量 | 保存条件 |
| 吸附液* | 88ml | 避光室温保存 |
| 洗净液* | 132ml | 室温保存 |
| 磁珠 | 7ml | 室温保存 |
*吸附液，洗净液在低温情况下会析出结晶。请一边用手捂暖，一边
将其倒转混合让结晶溶解后使用。另外，吸附液及洗净液内含有蛋白
变性剂。在使用时务必注意，万一沾到身体，请立刻用清水冲洗。
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品
1．试剂
·灭菌蒸馏水<溶出液>
·75％乙醇<洗净用>
2．器具，器材
·1.5ml小型试管用磁性台架
·简易台式离心机
·漩涡混合器
·Heat Block 55℃（用于在需要去除混于回收液中的乙醇的场合）
*可使用本公司的磁性台架Magical Trapper（Code No.：MGS-101）等产品。
[5] 回收DNA溶液
1．前言
·本操作程序用于从DNA溶液（约100μl）中回收DNA片段。
·能够回收的DNA大小约为100bp～50kb。另外，40bp以下的核酸
几乎能够被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量为每30μl磁珠大约吸附5μg。使用时请以2.5μg左右为参考量。
·能够从PCR反应液，限制酶反应溶液，碱性磷酸酶反应液等各种反
应液中回收DNA。
·回收后的DNA，能够用于限制酶处理、测序、连接、标记、杂交等多种反应
2．操作程序
DNA溶液（100μl）1）
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不时用漩涡混合器搅拌，并放置约1～2min（室温）
B/F（固/液）分离3）
↓←（600μl洗净液）4）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。3）
↓←1ml75％乙醇4）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。3）
瞬时高速离心，彻底去除上清部分。
（打开小型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥）4）
↓←25～100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec，
（在无法充分将粒子分离的情况下，请用pipetting来分离粒子。）
↓放置2min
B/F分离，回收上清液。5）
1）请尽量不要含矿物油。
2）使用磁珠前，请彻底悬浊混合后再使用。
3）将试管放置在磁性台架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持续去除
上清部分。通过乙醇清洗时，可以通过将上清液倒入其他容器进行去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架，但也可用简易台式离心机，用大约6,000r.p.m程度，5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化，所以请调整旋转数，使得能更有效地集合粒子，并保证凝结不至于过度。
4）请参照3.的表。
5）回收液中少量混入的磁珠并不会有碍下一次的反应，但在测定吸附度
等场合时，请通过瞬时高速离心除去磁珠。
3．关于工序的省略，纯化规模
·洗净工序，加热工序可以省略（请参照下表）
| 用途 | 洗净 | 干燥 | 备注 | |
| 洗净液 | 75％乙醇溶液 | |||
| 测序，限制酶反应，连接反应等的前处理 | － | 1次 | － | 标准操作程序。回收的核酸能用于Low Buffer系列的限制酶切断。 |
| 盐的混入会产生影响的场合 | － | 2次 | － | 吸附液和洗净液含有高浓度的盐分。 |
| 乙醇的混入会产生影响的场合 | － | 1次（2次） | 55℃，5min | 用于易受乙醇影响的前处理。 |
| 要去除混入的酶的场合 | 1次 | 1次（2次） | － | 用于去除碱性磷酸酶等。 |
| 要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液内含有能吸收紫外线的物质。 |
·根据DNA溶液的量，可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时，无需减少75％乙醇溶液的使用量。
[6] 回收琼脂糖凝胶
1．前言
·本操作程序适用于从TAE或者TBE琼脂糖凝胶（约0.3g）中回收
DNA片段。本操作程序是以琼脂糖浓度2％以下的凝胶为对象。
要使用2％以上的凝胶时，推荐所使用凝胶的量少于0.3g。另外，本
操作程序不需要使用特殊的低融点琼脂糖凝胶。
·能够回收的DNA大小约为100bp～50kbp。
·回收后的DNA主要用于连接反应、标记、测序等反应。
2．操作程序
琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。
↓
在UV照射下（Long wave），为了使得目标条带尽可能地变小，使
用切割刀或手术刀等进行切开。
↓
把切开的琼脂糖切细，放到1.5ml小型试管中。（此时称得重量，如
果大于0.3g则分几次进行。）1）
↓←400μl吸附液
在凝胶完全溶解之前，将其放置在室温中，并不时进行搅拌。2）
↓←30μl磁珠3）
↓经常用漩涡混合器搅拌，并放置2min（室温），
B/F分离。4）
↓←600μl洗净液
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。4）
↓←1ml75％乙醇溶液5）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。4）
瞬时高速离心，彻底去除上清部分。
（打开微型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥）5）
↓←25～100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec
（在无法充分分开粒子的情况下，请用pipetting来分散粒子。）
↓放置2min
B/F分离，回收上清液6）
1） 将琼脂糖凝胶制成切片，以利于溶解。
2） 如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或凝胶难以溶解时，请加温至55℃
5min。
3） 使用磁珠前，请彻底混合后再使用。
4） 将试管放置在磁性台架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持续去
除上清部分。要洗净乙醇，也可以通过将上清液倒入其他容器来去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架，但也可使用简易台式离心机，用大约6,000r.p.m程度，5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化，故请调整旋转数，使得更有效地集合粒子，并保证凝结不至于过度。
5） 请参照3.的表。
6） 回收液中混入少量磁珠并不会有碍下一次的反应，但在测定吸附
度等场合时，请通过瞬时高速离心除去磁珠。
3．关于工序的省略，纯化规模
·洗净工序，加热工序可以省略（请参照下表）
| 用途 | 洗净 | 干燥 | 备注 | |
| 洗净液* | 75％乙醇溶液 | |||
| 连接反应, 测序等 | 1次 | 1次 | － | 标准操作程序。 |
| 盐的混入会产生影响的场合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液和洗净液中含有高浓度的盐分。 |
| 乙醇的混入会产生影响的场合 | 1次 | 1次（2次） | 55℃，5min | 用于容易受乙醇影响的前处理。 |
| 要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液内含有吸收紫外线的物质。 |
*从琼脂糖凝胶中回收核酸时，必须用洗净液清洗。
·根据DNA溶液的量，可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时，无需减少75％乙醇溶液的使用量。
[7] 疑难解答
1．回收量低
| 原因 | 对策 |
| 去除乙醇不彻底 | 瞬时高速离心后，请仔细去除75％乙醇溶液。 |
| 溶出不充分 | 通过10mM Tris-HCI（pH8.0），或者TE buffer能够提高溶出的效率。另外，如果加温至55℃保持2min能够更加有效地提高溶出效率。 |
| 吸附时间不合适 | 如果吸附过剩，回收量则会变少。最恰当的吸附时间是，对于DNA溶液为1～2min，对于凝胶则为2min。 |
| 溶出时的搅拌不充分 | 溶出时，如果磁珠的混合不充分，回收量会减少。在瞬时高速离心后，磁珠会在底部结块，请仔细将其散开。特别是在从琼脂糖凝胶中进行纯化的时候，结块的磁珠会比较难以重新散开。 |
| 琼脂糖凝胶的量大于0.3g | 请减少琼脂糖凝胶的量。 |
| 使用2％以上的琼脂糖 | 请减少琼脂糖凝胶的量。 |
| 没有用洗净液清洗 | 从琼脂糖凝胶中回收DNA时，请务必先用洗净液清洗。 |
2．回收的核酸的吸光度不准确
| 原因 | 对策 |
| 清洗不充分 | 吸附液中含有吸收紫外线的物质。要对回收的核酸定量，请用洗净液以及75％乙醇溶液来清洗。 |
| 混入了吸附液 | 吸附液中含有吸收紫外线的物质。请仔细去除吸附液。用面纸等擦拭试管的盖子上沾有的吸附液，可以有效改善状况。 |
3．回收后的核酸不能良好地进行反应
| 原因 | 对策 |
| 盐阻碍了反应 | 请添加两次75％乙醇溶液进行清洗的工序。吸附液和洗净液都含有高浓度的盐分。 |
| 乙醇阻碍了反应 | 请按照操作程序，对乙醇进行干燥处理。 |
| 酶未能完全去除 | 要去除反应液中的碱性磷酸酶等酶，请用洗净液以及75％乙醇溶液进行清洗。 |
| 反应用的酵素过少 | 从琼脂糖凝胶中回收核酸时，反应用的酶量应比通常要多，这样就能得到准确良好的结果。 |
| 使用的琼脂糖级别不够 | 请使用高级别的琼脂糖。 |
| 从琼脂糖凝胶中分离条带时，受到的紫外线照射过多 | 请用Long wave（365nm附近）的紫外线来进行切片工作。 |
