细菌的分离培养与接种技术

绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。
细菌分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。通过分离，可使细菌在平板上分散生长，便于观察单个菌落特性，也易于挑取单个菌落，进行生化鉴定。
一、基本条件
细菌分离培养的基本条件包括接种用具(接种环、接种针)、培养箱、培养基，以及无菌室和超净工作台等。
(一)接种用具
包括接种环和接种针两类。接种环用来挑取标本、菌液及平板划线等。接种针则用来挑取单个菌落，穿刺高层琼脂等。接种环(针)由环(针)、金属柄和绝缘柄3部分组成，环(针)一般采用铂丝制作最佳，其硬度适宜，易于传热，火焰灭菌后冷却快，经久耐用。但因其价格昂贵，目前多用电热(镍)丝及l次性塑料接种环代替。
接种环的直径一般为2～4mm，长5～8cm，定量接种环容量为1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培养。
(二)培养箱
1．普通培养箱可自动调节培养温度(一般为35～37℃)，用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。
2．二氧化碳培养箱可自动调节二氧化碳浓度(一般为5％～l0％)和培养温度，用于分离培养嗜血杆菌和奈瑟菌等生长时需二氧化碳的细菌，尤其是初次分离培养时。如无二氧化碳培养箱时，也可用烛缸法代替。
3．厌氧袋、厌氧罐(盒)和厌氧手套箱用于分离培养厌氧菌。厌氧袋为透明的、不透气的塑料袋。厌氧罐为密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化学方法去除袋、罐中的氧气，达到无氧状态。厌氧手套箱则可通过换气装置快速达到、持续保持无氧状态，并自动调节培养温度，还可通过手套在箱内进行分离接种、生化鉴定等操作。
(三)培养基
培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的，适合微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、化学特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。培养基按其性状分为固体、半固体和液体培养基；按其用途分为基础、营养、选择、鉴别和特殊培养基。
1．基础培养基(based medium) 含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基础培养基广泛用于细菌的增菌、检验，也是制备其他培养基的基础成分。
2．营养培养基(nutrient medium) 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血琼脂平板、巧克力平板等。
3．选择培养基(selective medium) 在培养基中加入选择性抑制物质，有利于目的菌的检出和识别，而抑制其他非目的菌。例如，麦康凯琼脂平板可以抑制球菌及革兰阳性杆菌生长，有利于肠道菌生长，称弱选择性培养基；SS琼脂平板除有上述作用外，还可
抑制肠道非致病菌的生长，故称强选择性培养基。
4．鉴别培养基(differential medium)利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用于观察细菌各种生化反应，以鉴别和鉴定细菌。例如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂(KIA)、伊红-亚甲蓝(美蓝)琼脂等。
5．特殊培养基(special medium) 包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。前者是培养专性厌氧菌的培养基，除含营养成分外，还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势。后者是针对细胞壁缺损的细菌L型，由于胞内渗透压较高，故培养基必须采用高渗低琼脂培养基。
二、接种分离技术
为了从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，除选择好合适的培养基外，还要根据待检标本的来源、培养目的及所使用培养基的性状，采用不同的接种方法。
（一）平板划线分离法
使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落。一般要求单个菌落是一种细菌的纯培养。但很多情况下单个菌落并非只有一种细菌，特别是标本直接划线的开始区域生长的单个菌落分离结果不纯，一般选择菌落形成较稀少区域的单个菌落，必要时先稀释标本再划线。待菌落长出，后，挑选单个菌落，转种到另一培养基中，继续实验。平板划线法可分为以下几种：
1．分区划线法此法多用于粪便等含菌量较多的标本。先将标本均匀涂于平板表面边缘一小部分(第1区)；然后烧灼接种环，将环通过第l区3～4次，连续划线(为第2区)；依次划3、4区。平板上每l区的细菌数会逐渐减少，直至分离出单个菌落(图5-4)。
2．连续划线法本法一般用于接种含菌数量相对较少的标本或培养物。先将标本均匀涂布于平板边缘一小部分，并由此开始，在平板表面连续划线并逐渐下移，直至划满平板表面。
3．棋盘格划线法此法多用于含菌量较多的临床标本，如痰、粪便等标本的初代分离培养。其优点是整个平板的3/4～4/5区
域(即棋盘格范围)均为有效分离区。将标本涂布于平板约l/5处，接种环经火焰灭菌后，自原处做平行划线5～6条。接种环烧灼后冷却，划垂直线5～6条，形成正方形格；再以同法划两排斜线，使呈棋盘形。
(二)斜面接种法
该法主要用于纯种增菌及保存菌种。挑取单个菌落从斜面底部自下向上划一条直线，再从底部开始向上划曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上划曲线接种。
(三)液体接种法
以接种环沾取菌种，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体应淹没接种物为准)。多用于普通肉汤、蛋白胨水等液体培养基的接种。
(四)穿刺接种法
此法用于保存菌种、观察动力及某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种针。其他操作与斜面接种类似。
(五)倾注平板法
取纯培养物的稀释液或原标本，混匀于已融化并冷却到50℃左右15ml的琼脂管中，无菌法倾注于无菌平皿，凝固后培养，进行菌落计数。该法适用于兼性厌氧菌或厌氧菌稀释定量培养，也用于饮料、牛乳和尿液等液体标本活细菌计数。